康宁克通或干扰素局部注射对瘢痕PDGF BB基因表达影响

中华整形烧伤外科杂志 1999年第4期第15卷 论著

作者：徐少骏　鲍卫汉　杨晓林　李东

单位：北京医科大学第三医院成形外科研究中心　100083

　　关键词： 增生性瘢痕；PDGF；BB；基因原位表达；康宁克通；干扰素α-2b

　　【摘要】　目的　明确康宁克通和干扰素α-2b对增生性瘢痕成纤维细胞的抑制是否通过PDGF途径。方法　对6例增生性瘢痕同一个体分区域同时局部注射康宁克通或干扰素α-2b后3天及7天的PDGF bB mRNA原位表达进行了观察。结果　①康宁克通或干扰素α-2b在局部注射后7天增生性瘢痕的PDGF bB mRNA表达强度比未注射区均明显减少(P＜0.01)，但局部注射后3天表达强度与未注射区相比均无显著性差异(P＞0.05)。②增生性瘢痕的PDGF bB mRNA原位表达强度高于正常皮肤。结论　激素及干扰素α-2b治疗瘢痕的机制之一是通过抑制PDGF基因表达，从而减少成纤维细胞的有丝分裂，使瘢痕的成纤细胞增殖受到抑制。

Effects of intralesional injection of kenalog or interferon α-2b on PDGF BB gene expression in situ of hypertrophic scars

XU Shaojun, BAO Weihan, yANG Xiaolin,et al.The Research Centre of Plastic Surgery,The Third Clinical school of Beijing Medical University,Beijing 100083

　　【Abstract】　Objective　The study is to determine whether kenalog or interferon α-2b inhibits fibroblast growth in hypertrophic scars through decreasing PDGF.Method　Six patients with hypertrophic scars received intralesional injection of kenalog or interferon α-2b.On the 3rd and 7th day after injection,scar samples from each patient were collected and PDGF mRNA expressions in situ were studied.Results①On the 7th day after intralesional injection of kenalog or interferon α-2b,expressions of PDGF BB mRNAs decreased significantly (P＜0.01).However,on the 3rd day the expressions of PDGF BB mRNAs of the intralesional-injected area and non-injected area were not significantly different (P＞0.05).②Gene expressions of PDGF BB in situ were higher in hypertrophic scars than in normal skin.Conclusion　The mechanism of kenalog or interferon α-2b in ameliorating hypertrophic scar is to reduce mitosis and prohibit proliferation of fibroblasts in hypertrophic scars by inhibiting PDGF gene expression.

　　【Key words】　Hypertrophic scars　　PDGF bB　　mRNA expression in situ　　Kenalog　　Interferonα-2b

　　增生性瘢痕是由于皮肤深层的损伤所致，以过多的胶原沉积为特征。其生成与成纤维细胞的增殖及皮肤创伤的持续过度修复有关。血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)被证实能促进成纤维细胞的有丝分裂^［1］，而成纤维细胞、单核巨噬细胞及平滑肌细胞能形成和分泌PDGF。我们发现氢化可的松及干扰素α-2b能抑制瘢痕疙瘩及正常皮肤的成纤维细胞生长^［2］。为探讨激素及干扰素α-2b对在体增生性瘢痕是否通过PDGF途径对瘢痕成纤维细胞产生抑制，对6例增生性瘢痕局部注射康宁克通(醋酸去炎松)及干扰素α-2b，然后对组织中细胞的PDGF基因原位表达情况进行了研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　组织来源：实验采用6例标本取自北京医科大学第三医院成形外科烧伤后增生性瘢痕病例，并从未使用过任何局部用药。男5例，女1例。年龄7～48岁。病变部位为腋下、手臂、前胸及面颊。病程1～2年。

　　1.1.2　PDGF-BB cDNA探针，中国人民解放军军事医学科学院。

　　1.1.3　康宁克通(醋酸去炎松)，德国西斯平(Astrapin)大药厂。

　　1.1.4　干扰素α-2b，美国Schering-Plough公司。

　　1.2　方法

　　1.2.1　组织取材前处理：对6例分别于术前7天及3天向每一增生性瘢痕内同时分区段注射康宁克通(40mg/ml)或干扰素α-2b(150万U/ml)，所有瘢痕直径均在8cm以上，厚度1cm以上，注药区段间间隔4～5cm或以上，注药量以瘢痕组织变白为止，深度小于1cm。每一患者于手术切除瘢痕时取注药区(7、3天康宁克通及干扰素α-2b)标本4块及未注药区的标本1块，注药区标本为在该区中央切取，0.5cm×0.5cm×0.5cm大小，以保证所取标本曾受注射。同时取4例大腿部正常皮肤。取材后置液氮保存。

　　1.2.2　cDNA探针的标记：用地高辛随机引物探针标记及检测试剂盒(Mannhein德国)按说明步骤标记探针。

　　1.2.3　mRNA的原位杂交^［3］：将液氮冻存的标本切成8～10μm的冰冻切片，经处理后，42℃预杂交4h，然后去除预杂交液，加含标记探针浓度为500ng/ml的杂交液，42℃杂交16h。

　　1.2.4　杂交信号的检测：用地高辛试剂盒按说明步骤对杂交信号进行检测。

　　1.2.5　阴性对照：①杂交前标本加RNA酶消化RNA，加标记的探针进行杂交。②杂交液中加未标记的cDNA探针进行杂交。③杂交时加标记的cDNA探针，检测时不加地高辛抗体。

　　2　结果

　　光镜下观察，呈蓝色、浅蓝色或紫红色为阳性信号(图1)，阴性对照组未见阳性信号(图2)。阳性信号根据细胞及组织形态主要表达在成纤维细胞、炎性细胞及血管壁上。

图1　PDGF原位杂交阳性信号(×400)

　　Fig 1　Positive signals of PDGF gene expression in situ(×400）

图2　阴性对照

　　Fig 2　Negative contral

　　信号的强弱根据以下方法进行评估：用武汉产格式显微测微尺在400×光镜下数10个0.0052mm²面积中的阳性信号，将其相加，作为1个0.052mm²中的阳性信号数，每个标本随机观察10个0.052mm²面积的阳性信号数，取平均值。每例标本的阳性信号均值反映了PDGF的mRNA的原位表达强度。6例增生性瘢痕注射及未注射康宁克通或干扰素α-2b pDGF mRNA原位表达强度及注药后与未注药组作配对t检验见表1。4例正常皮肤的阳性信号只有极少量或没有表达(0～6个阳性信号)。

　　因此，从本实验可得到以下结果：①康宁克通局部注射后3天，虽PDGF基因原位表达强度下降，但统计学上差异无显著意义。至注射后7天，PDGF基因表达被明显抑制。②干扰素α-2b局部注射后3天，PDGF基因表达未受明显抑制。注射后7天，PDGF基因表达被明显抑制。③增生性瘢痕的PDGF基因表达多于正常皮肤。

表1　瘢痕注药区及未注药区PDGF基因表达

　　Tab 1　PDGF mRNA expressions in situ of hypertrophic scars

　　with intralesional injection and without intralesional injection

项目	未注药区	注射康宁克通区		注射干扰素区
		7天	3天	7天	3天
信号 　　强度	46.98±10.27	27.87±3.22	36.53±5.35	28.75±2.69	39.77±3.51
t值		4.3502	2.2100	4.2067	1.6287
P值		＜0.01	＞0.05	＜0.01	＞0.05

　　3　讨论　　皮肤增生性瘢痕一般是皮肤创面持续过度修复的结果，其主要原因之一是成纤维细胞的过度增殖活化及迁移。而PDGF是激活成纤维细胞的一个重要因子^［4］，它能促使成纤维细胞从G₀/G₁期进入S期，从而使DNA合成，细胞增殖。同时PDGF的效应可通过自分泌和旁分泌等局部作用完成，局部能分泌PDGF的细胞多少及分泌的量决定局部PDGF的浓度^［5］。PDGF可分为AA、BB和AB3类，有学者通过实验发现PDGF-BB对瘢痕疙瘩成纤维细胞有丝分裂的刺激是正常皮肤的2倍，正常皮肤成纤维细胞对PDGF aB和BB刺激产生的化学趋化性反应较强^［6］。本实验的结果提示PDGF增多在增生性瘢痕的形成中是重要因素之一，PDGF的增高促使成纤维细胞增殖及趋化，而增殖的成纤维细胞又不断分泌PDGF，如此形成恶性循环而使瘢痕不断增生。

　　激素治疗瘢痕已有40余年的历史，对瘢痕疙瘩及正常皮肤的成纤维细胞能产生抑制作用^［2］，主要是使DNA含量减少，但激素通过什么途径使DNA合成受到抑制，本实验结果提示通过抑制PDGF的mRNA表达可以阻止PDGF的产生，无疑是其中的一条重要途径，同时发现这种对PDGF基因表达的抑制不是即刻产生而需长达数日，其具体机制尚需进一步探讨。

　　干扰素α-2b亦能抑制瘢痕疙瘩及正常皮肤的成纤维细胞的生长。干扰素α-2b属于细胞因子，有较强的抗肿瘤活性。本实验结果提示干扰素α-2b能抑制PDGF的基因表达，且这种抑制作用亦需长达数日，干扰素α-2b对PDGF的抑制是直接作用还是需依赖其它的生长、细胞因子或因素目前还不明确。

　　本课题受邱武才基金赞助

　　参考文献

　　1　Kohler N,Linpton A.Platelets as a source of fibroblast growth-promoting activity. Exp Cell res,1974,87:297-301.

　　2　徐少骏，鲍卫汉，王志刚.激素和干扰素对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长影响研究.中华医学美容杂志，1997，3：4-6.

　　3　卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993：229-239.

　　4　Pierce GF,Mustoe TA,Altrock BW,et al.Role of platelet-derived growth factor in wound healing.J Cell Bio Chem,1991,45:319-326.

　　5　Ross R,Raines EW,Browen-Pope,et al.The biology of platelet-derived growth factor.Cell,1986,46:155-169.

　　6　Im Mj,Mulliken JB,Hoopes JE.Effects of intralesional injection of triamcinolone on glucose-6-phospate dehydrogenase and alanine aminotransferease activity in keloids.Plast Reconstr Surg,1975,56:660-663.

(收稿：1997-12-01　　修回:1998-06-18)

......