膜状成骨与软骨成骨贴附移植后的组织学观察及骨计量学分析

中华整形烧伤外科杂志 1999年第4期第15卷 论著

作者：杨斌　赵敏　熊斌　刘珍君　刘元波　郭永刚　靳晓雷

单位：北京，中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院　100041

　　关键词： 贴附骨移植；骨计量学

　　【摘要】　目的　深入探讨骨贴附移植后的变化及不同胚胎来源骨质(膜状成骨和软骨成骨)移植后的差异。方法　应用新西兰兔、恒河猴采用荧光素双标记法，在不脱钙骨切片上，选用类骨质宽度、骨质矿化沉积率、荧光标记率等骨动力学指标对骨移植后的再生和改建进行计算机图像分析和定量测量。结果　骨体积存留率：膜状成骨为(78.4±3.5)%，软骨成骨为(56±5.1)%；骨矿化沉积率：膜状成骨为(3.60±0.8)μm/d，软骨成骨为(0.92±0.33)μm/d；类骨质宽度；膜状成骨为(14.56±2.69)μm，软骨成骨为(7.38±2.20)μm；荧光标记率：膜状成骨为(91.22±2.69)%，软骨成骨为(51.28±4.11)%。结论　膜状成骨移植后较软骨成骨可保持更多的骨质体积,有更为明显的成骨再生能力且可诱导宿主骨成骨的能力不同，膜状成骨优于软骨成骨。

Histological study and stereologic analysis of membranous versus endochondral onlay bone grafts

YANG Bin,ZHAO Min,XIONG bin,et al.The Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences, baDaChu,Beijing 100041

　　【Abstract】　Objective　The experimental study was to determine the differences in changes in the onlay bone grafts of different embryonic origin.Methods　The study was designed to compare the potential for appositional bone growth in membranous and endochondral onlay grafts in New-Zealand rabbits and a rhesus monkey.Results were assessed with volumetric measurement,histological examinations and stereologic analysis with double-fluorochrome labeling technique.Results　For the membranous and endochondral bone grafts,the volumetric retention rate was(78.4±3.5)% and (56.0±5.1)% respectively.The mineralization apposition rate(MAR) was (3.6±0.8) μm/d and (0.92±0.33)μm/d;the osteoid seam width (OSW) was (14.56±2.69) μm and (7.38±2.20)μm;the tetracycline uptake rate(TUA) was (91.22±2.69)% and (51.28±4.11)%,respectively.Conclusion　①　It was found that the membranous bone graft maintained its volume to a significantly greater extent than the endochondral bone graft;② membranous bone grafts exhibited higher survival rate and greater activity than endochondral bone grafts;③ different changes were also found in the two recipient sites.There was more powerful bone regenerative reaction in the recipient bed of the membranous bone graft than the endochondral one.

　　【Key words】　Onlay bone grafts　　Stereologic analysis

　　贴附骨移植(Onlay bone grafting)被广泛用于颅颌面骨质畸形和缺损的整复治疗。传统供骨区多采用软骨成骨来源的髂骨、胫骨。随着颅颌面外科技术的发展，膜状成骨的颅骨、颧弓、下颌颏部正中骨质用于临床日益增多^［1，2］。这促使各国学者对两种骨质移植后的变化进行了多方面的实验观察和研究，其中包括：骨质胚胎起源、植入部位和方向、皮质骨与松质骨的比率、骨膜的保留、固定方式、植骨年龄、软组织床情况等方面^［3-11］。但由于受观测条件和方法的限制，以上的实验均以组织学说明骨移植后的变化。而未能动态、准确、定量地反映出移植骨以及宿主骨移植后的变化和差别。因此我们设计本组实验，应用骨组织形态计量法^［12］，通过计算机图像分析系统对两种不同胚胎起源的骨质移植后变化进行观测和定量分析。

　　1　材料和方法

　　新西兰兔5只，体重2.5～3kg，兔龄6个月。复方塞胺酮麻醉后，取5mm×10mm的颅骨和髂骨骨块，测量并记录体积。去除髂骨单侧骨皮质，将其松质骨面朝下与颅骨块排成一列植入兔口鼻部骨膜下，颅骨块在前端，髂骨块在其后，分层缝合骨膜和皮肤。术后33、34两天，分别肌注四环素每次50mg/kg，第41、42两天以相同剂量再次注射。第45天切开兔口鼻部，显露移植骨，用印模材料复制移植骨块模型，翻制石膏块测量其体积。将移植骨块及宿主骨一同取下，置入70%酒精固定。雄性恒河猴1只，3岁，体重7kg，分别切取5cm×10cm大小的下颌部正中和髂骨(去除单侧骨皮质)骨质，各4块，测量体积后对称植入头颅中线两侧的骨膜下，3个月后取石膏模型再次测量移植骨体积，截取移植骨及宿主骨置入70%酒精固定。

　　固定、脱水后，甲基丙烯酸甲酯包埋，Jung-K切骨机切制7μm不脱钙骨切片，每个标本切片5张，保留平片，其余行Giemsa和Von-Kossa染色，每张切片在Olympus-BH2型光镜和荧光显微镜下随机选择5个视野进行观察，并经摄像头将图形摄入IBM-2248型计算机，应用MPIAS-500型多媒体彩色病理图文分析系统，选用四环素标记率、类骨质宽度、骨矿化沉积率指标进行测量，结果作t检验。

　　2　结果

　　2.1　移植骨体积变化　见表1,2。

表1　1.5个月移植骨体积变化

　　Tab 1　Graft volumes (After 1.5 months)

动物 　　序号	颅骨(ml)			髂骨(ml)
	移植前	后	存留率(%)	移植前	后	存留率(%)
1	0.12	0.09	82	0.20	0.11	55
2	0.10	0.08	80	0.26	0.14	54
3	0.11	0.08	73	0.20	0.10	50
4	0.13	0.10	77	0.22	0.14	64
5	0.15	0.12	80	0.21	0.12	57

移植骨体积存留率=术后骨体积/术前骨体积×100%

表2　3个月移植骨体积变化

　　Tab 2　Graft volumes (After 3 months)

骨块 　　序号	颏部正中(ml)			髂骨(ml)
	移植前	后	存留率(%)	移植前	后	存留率(%)
1	0.28	0.24	84	0.28	0.21	75
2	0.29	0.24	82	0.27	0.20	74
3	0.24	0.19	79	0.22	0.16	73
4	0.23	0.18	78	0.26	0.18	69

移植骨体积存留率=术后骨体积/术前骨体积×100%

　　1.5个月时，颅骨体积存留率是(78.4±3.5)%(x±s),髂骨体积存留率为(56±5.1)%(x±s)。3个月时，颏部正中体积存留率是80.5%，髂骨体积存留率是72.6%。

　　2.2　组织学观察

　　2.2.1　骨移植1.5个月的组织学变化　颅骨基本保持了原有骨质的结构框架，有大量的成骨细胞围绕骨髓腔呈线型排列，成骨细胞呈立方状，胞浆丰满，增生活跃。宿主骨内亦可见大量成骨细胞。移植骨和宿主骨内的成骨表面有丰富的类骨质形成(图1)。荧光检查示移植骨内可见丰富的荧光标记区，标记线多为双标记，线间距离明显，增生活跃(图2)。宿主骨内及界面亦可见明显的双标记线及标记区。髂骨移植后，其骨质大部分坏死吸收，呈网状联接结构，骨组织结构松散，其间可见散在的残存骨小梁(图3)。骨小梁表面可见纤维结缔组织包绕，周围伴有丰富的小血管丛。部分成活的骨小梁表面可见少量成骨细胞，局部有少量类骨质形成。宿主骨内可见部分成骨细胞活动，多为扁平或梭形，类骨质沉积量少，界面多为纤维性联接，骨性愈合不显著。荧光检查：移植骨中可见大片的无荧光区，为吸收坏死部分，残留骨小梁表面可见洼陷吸收。荧光双标记线少且间距窄，部分为单标记线(图4)。宿主骨内及界面处可见荧光标记，但范围、密度、增生活跃程度明显较低。

　　2.2.2　恒河猴骨移植3个月的组织学变化3个月后　膜状成骨和软骨成骨都有明显的修复再生，膜状成骨中已形成大量的编织骨，排列密集并逐渐向板状骨转化，与宿主骨完全融合，界面已不易区分(图5)。软骨成骨中的吸收坏死区正逐步被新生骨质所修复，可见成骨细胞已逐步被埋入新生骨小梁中，有部分界面骨性愈合(图6)。

图1　膜状成骨移植后保持了原有骨质结构，其内部有丰富的类骨质形成(Von kossa×4)

　　Fig 1　The original bone architecture was still remained in membranous bone graft, with evidence of new osteoid formation

图2　膜状成骨中荧光双标记区密度大，双标记线间距宽(×10)

　　Fig 2　The intense continual double labeling with obvious space were visible in membranous bone grafts

图3　软骨成骨移植后，骨质大部分坏死吸收，骨质结构松散，塌陷，其间可见散在的残存骨小梁，骨小梁表面缺乏类骨质(Von kossa×4)

　　Fig 3　There were obvious signs of bone necrosis and resorption in endochondral bone grafts. The architecture of trabecula was disappeared and collapsed. Some residual trabecula scattered in grafts and its surface was absent of new osteid

图4　软骨成骨内双标记线窄，部分为单标记(×20)

　　Fig 4　There were less intense and narrow double labeling in endochondral bone grafts, with single-labeling in some

图5　膜状成骨移植3个月后，骨质修复良好，骨性愈合，界面不易区分(Von kossa×4)

　　Fig 5　Postgrafting 3 months. The membranous bone grafts showed extensive repair, with full incorporation at the graft-host-interface, making graft and host architecture indistinguishable

图6　软骨成骨移植3个月后，可见骨质修复并恢复了骨质结构的连结，界面部分骨性愈合，部分仍有间隙(Von　Kossa×4)

　　Fig 6　Postgrafting 3 months. The endochondral bone grafts showed extensive evidence of trabecularization and restored the connection of bony architecture. Partial incorporation was defined as bony bridging at the graft-recipient interface. The microscopic gaps were still observed(15)

　　2.3　骨组织形态计量学测量

　　选用骨矿化沉积率、类骨质宽度、荧光标记率指标对移植骨和宿主骨进行骨计量学测量。定量分析移植骨荧光标记率：膜状成骨为(91.22±2.69)%,软骨成骨为(51.28±4.11)%，余见表3，4。

表3　骨矿化沉积率

　　Tab 3　Mineralization apposition rate MAR

观察部位	膜状成骨(μm/d)	软骨成骨(μm/d)	P值
移植骨	3.60±0.8	0.92±0.33	＜0.01
宿主骨	3.19±0.37	2.18±0.36	＜0.01

表4　类骨质宽度

　　Tab 4　Osteoid seam width OSW

观察部位	膜状成骨(μm/d)	软骨成骨(μm/d)	P值
移植骨	14.56±2.69	7.38±2.20	＜0.01
宿主骨	14.35±3.48	5.82±1.68	＜0.01

　　3　讨论3.1　骨体积测量被认为是观察骨移植后变化的重要指标，在骨移植研究中常被采用。通过对骨移植(兔)1.5个月、(猴)3个月的观察测量，本实验结果进一步验证了其他学者的研究成果^{［3，4，6-8］}，即膜状成骨移植后较软骨成骨保持了更多的骨质体积。

　　3.2　以往的组织学观察表明贴附骨移植4～6周内有明显的骨质再生与改建，此后随着移植骨改建、愈合过程的发展而逐渐减弱^［8］，故本组实验选择在此期间进行荧光双标记，对骨移植进行观察分析。

　　由于四环素与矿物盐之间存在着特殊的亲和性，因而注入后能够迅速沉积于活跃成骨部位的矿化前沿(minerlization front)形成荧光线，通过计算机图形分析测量①荧光标记线长度占全部骨表面长度所占的百分比，即荧光标记率；②测量类骨质到髓腔表面的平均距离，即为类骨质宽度；③测量两次标记所形成四环素双标记线之间的平均距离除以两次给药间隔的天数，即为骨矿沉积率。通过选用上述骨动力学指标对两种不同胚胎起源骨质在同一时间段内的变化进行动态定量观测分析。结果表明：两种骨质移植后骨质再生修复的速度与成骨量不同，膜状成骨较软骨成骨有更为迅猛的骨质再生修复，因而促使了膜状成骨移植后保持了更多的骨质体积。这个结论与Zins等^［3］提出的“膜状成骨与软骨成骨移植后成骨速率相同，软骨成骨移植后的体积丧失必定是由于快速的吸收”的观点不同。

　　3.3　以往对宿主骨的研究多限于观察在颅颌面部不同区域宿主骨表面(如活动区与不活动区、吸收区与沉积区)行骨移植后变化的比较，往往缺乏对宿主骨本身变化的观察与研究^{［3，4，7，8］}。而本实验结果表明，对于两种骨质的移植，宿主骨产生了明显不同的宿主反应，膜状成骨移植后其受区可产生更为积极的成骨活动，这可能更有利于移植骨的成活及与界面的及早愈合。Holmes^［13］和Ferraro^［14］提出：骨移植中供区与受区结构间的相近，对于移植物成活非常重要。同时考虑到髂骨是负重骨而颅骨是塑形骨，我们认为：两种骨质移植后宿主骨成骨能力的差异，应从胚胎起源和移植物的结构以及骨质原有的功能方面考虑。

　　3.4　本实验观察到软骨成骨移植骨内有丰富的小血管丛，但它旁边仍可有残存、坏死骨小梁。而膜状骨中血管化的程度明显低于软骨成骨，但却有活跃的成骨反应，这进一步支持了我们在关于不同胚胎起源骨质移植后早期血管化研究中所提出的软骨成骨移植后较膜状骨有更加迅速血管化的结论，以及有关骨质结构、血管化程度与骨质体积变化关系之间的推论^［15］。

　　3.5　最后我们认为骨移植是一个完整的动态过程，应进一步进行系列观察及相应的定量分析，引入更多的骨计量学指标，从多方面深入了解骨移植后吸收、再生、改建修复的相应变化，以揭示骨移植后变化的全貌。

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　　15　杨斌，赵敏，刘珍君,等.膜状成骨与软骨成骨贴敷移植早血管化的实验研究.全国第五届整形外科专题研讨会论文汇编，1997：62.

(收稿：1997-11-03　　修回:1998-11-19)

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